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Aug 28, 2023

Structure de la solution de Pvfp recombinant

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 5, Article number: 739 (2022) Citer cet article

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Certains organismes marins peuvent résister aux environnements aqueux des marées et adhérer fermement aux surfaces humides. Ce comportement a suscité une attention croissante pour des applications potentielles dans la médecine, les biomatériaux et l'ingénierie tissulaire. Chez les moules, les forces d'adhérence à la roche sont la résultante de formations fibreuses protéiques appelées byssus. Nous présentons la structure en solution de Pvfp-5β, l'une des trois protéines de la plaque de byssal sécrétée par la moule verte asiatique Perna viridis, et le composant responsable de l'initiation des interactions avec le substrat. Nous démontrons que Pvfp-5β a une structure repliée de manière stable en accord avec la présence dans la séquence de deux motifs EGF. La structure est très rigide à l'exception de quelques résidus affectés par des mouvements locaux lents dans l'échelle de temps µs-ms, et diffère du modèle calculé par des méthodes d'intelligence artificielle pour l'orientation relative des modules EGF, ce qui est encore insuffisant pour les méthodes de calcul. . Nous montrons également que Pvfp-5β est capable de coacerver même sans modification DOPA, donnant ainsi un aperçu à la fois pour comprendre le mécanisme d'adhésion des protéines de moules adhésives et pour développer des biomatériaux.

La façon dont les organismes marins, tels que les moules, les étoiles de mer et les vers de sable, parviennent à adhérer si fermement aux surfaces humides pour résister à la force des marées et des vagues orageuses est un sujet d'intérêt croissant1. Ce n'est pas seulement en raison de l'importance de cette propriété pour l'industrie navale, pour laquelle le biofouling de surface est une préoccupation majeure, car il accélère la corrosion de surface qui nécessite un entretien de surface coûteux. Encore plus intéressantes sont les implications qu'une compréhension complète d'un mécanisme d'adhérence aussi serré pourrait avoir pour le développement de nouveaux biomatériaux avec des propriétés qui pourraient être exploitées en médecine régénérative, en génie tissulaire et en science des matériaux2,3.

Parmi les organismes marins dotés de propriétés d'adhésion, on trouve les moules qui ont développé une stratégie d'adhésion sous-marine forte grâce à la sécrétion d'un appendice filandreux à base de protéines appelé byssus. Celui-ci est constitué de filaments formés par des faisceaux de fibres entrelacées4. Chaque filament se termine par une plaque riche en protéines, contenant les protéines du pied de moule (mfps) caractérisées par des caractéristiques adhésives, qui agit comme une colle résistante à l'eau et permet à la fibre de s'ancrer fermement à différents substrats5,6. Chimiquement, la composition du byssus se compose de plusieurs protéines différentes qui sont toutes synthétisées dans le pied de moule, un grand organe qui, en eau douce, permet à la moule de traverser le substrat et de se déplacer. Le byssus est produit dans une rainure sur la face ventrale du pied et exsude sous forme de sécrétion visqueuse, qui durcit progressivement et forme des fibres au contact de l'eau, dans un processus de coacervation qui a des analogies avec la formation des fibres amyloïdes des peptides Abeta7.

Six protéines de pied de moule ont été identifiées dans le genre Mytilus le plus étudié (mfp-2, -3S, -3F, -4, -5 et -6)8. Les protéines de cet organisme ont de faibles énergies d'adhésion (<5 mN/m) et la particularité d'être biodégradables et donc respectueuses de l'environnement9, généralement non toxiques et avec de faibles propriétés de réponse immunitaire10. Une particularité des protéines du pied de moule est qu'elles contiennent l'acide aminé catécholique 3,4-dihydroxy-l-phénylalanine (DOPA), un dérivé de la tyrosine obtenu par modification post-traductionnelle11. Le DOPA est connu pour se lier à une grande variété de substrats grâce à sa capacité à former des liaisons hydrogène, des interactions hydrophobes, une coordination métallique et des liaisons covalentes12,13,14,15,16, et donc de nombreuses études se sont concentrées jusqu'à présent sur les polymères dérivés du DOPA pour développement de nouveaux biomatériaux adhésifs.

Dans une étude précédente, nous avons caractérisé la version non modifiée par DOPA d'une des protéines mfp de la moule verte asiatique Perna viridis (Pvfp-5β)17. Parmi les protéines produites par cet organisme qui incluent également Pvfp-3α et Pvfp-6, Pvfp-5β est la première à être sécrétée et à établir une interaction avec le substrat ce qui en fait un système particulièrement intéressant18. La séquence de cette protéine contient deux répétitions en tandem avec une homologie élevée avec les modules EGF et partage une identité de 47 à 50 % avec les répétitions EGF de la protéine Notch ligand Δ-like 117,18. Les motifs EGF sont des protéines tout-β caractérisées par trois ponts disulfure conservés, qui peuvent lier des ions calcium, et ils ont également été observés dans d'autres protéines adhésives de moules, telles que Mgfp-2 de Mytilus galloprovincialis12,19,20. Nous avons démontré qu'il est possible de produire du Pvfp-5β recombinant dans des bactéries et que le Pvfp-5β a une faible toxicité et des propriétés adhésives intrinsèques également en l'absence de modifications DOPA17, confortant la possibilité d'utiliser cette protéine comme biomatériau de revêtement de surface pour applications médicales, y compris la régénération des tissus endommagés. Ces résultats ont également été confirmés par d'autres études, qui ont démontré que les résidus DOPA-substitués ne sont pas nécessaires pour produire une forte adhérence résistante à l'humidité, et que les protéines DOPA-aminées n'ont pas de propriétés adhésives supérieures à celles des versions correspondantes non-DOPA-aminées5,21, 22. Nos résultats concordent également avec des études récentes qui ont mis en évidence l'importance des résidus de lysine (Lys) dans l'adhérence des moules23,24,25,26. En effet, la DOPA et la tyrosine sont toutes deux susceptibles de former des liaisons cation-π avec des résidus flanquants chargés positivement tels que la lysine, ce qui augmenterait la force de cohésion des couches adsorbées de mfps et induirait une séparation de phase liquide-liquide spontanée d'un complexe riche en protéines. phase fluide (coacervation complexe) dans des solutions salées27,28,29.

Plus récemment, une autre étude a montré que le Pvfp-5β modifié par DOPA et le Pvfp-5β non modifié sont en grande partie non structurés et que seul le Pvfp-5β modifié par DOPA présentait une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) dans des conditions semblables à celles de l'eau de mer, alors que le La version Tyr uniquement ne forme que des agrégats insolubles30. Ces résultats, en contradiction avec nos données, ouvrent deux questions importantes : si les protéines devaient être déstructurées, pourquoi la Nature a-t-elle utilisé le repliement EGF, qui est bien connu pour être replié de manière stable également grâce aux ponts disulfure ? Le DOPA est-il le seul paradigme pour développer de nouveaux bioadhésifs inspirés des moules ?

Pour explorer ces questions, nous avons fait un autre pas important vers la possibilité de comprendre les déterminants structurels des propriétés adhésives de Pvfp-5β en résolvant sa structure tridimensionnelle en solution et en établissant que, malgré l'absence d'un noyau hydrophobe approprié, la structure en solution est relativement rigide avec seulement des ralentis locaux. Nous prouvons également expérimentalement que le Pvfp-5β non modifié est capable de subir une coacervation simple à pH neutre ou basique, et décrivons le processus de coacervation provoqué par l'auto-assemblage de Pvfp-5β par amarrage moléculaire.

Nos résultats fournissent les bases pour mieux comprendre les déterminants structuraux des propriétés d'adhésion des protéines de moule.

Notre spectre RMN HSQC 2D 1H – 15N précédemment publié de Pvfp-5β non modifié laisse peu de doutes sur le fait que la protéine est repliée de manière stable et monomérique, affichant une dispersion des pics sur une plage de 9, 7 à 6, 7 ppm (Fig. S1 supplémentaire) 17. Nous avons alors décidé de procéder à la détermination de la structure RMN tridimensionnelle en solution de Pvfp-5β. Il convient de noter que le spectre HSQC de notre Pvfp-5β recombinante est assez différent de celui récemment publié par un autre groupe qui est cohérent avec une protéine pour la plupart non structurée30. La détermination de la structure RMN tridimensionnelle en solution de Pvfp-5β n'a pas été une tâche facile malgré la petite taille de la protéine. En effet, l'attribution des spectres RMN a nécessité un effort considérable en raison de la teneur élevée en tyrosines (20,5 %) et en prolines (9,6 %). Néanmoins, une attribution pratiquement complète a pu être obtenue (Fig. S1 supplémentaire) et, à l'exception de Pro12, presque toutes les chaînes latérales des résidus d'acides aminés Pvfp-5β ont été attribuées avec succès. La cession a été soumise à la base de données du BMRB sous le numéro d'accès 51091.

De manière intéressante, nous avons remarqué que les déplacements chimiques des douze cystéines ont toutes des valeurs compatibles avec leurs formes oxydées (Tableau complémentaire 1), contrairement à notre précédente détermination des ponts disulfure par spectrométrie de masse, qui avait confirmé la formation de seulement cinq des six passerelles possibles17. Nous avons cependant remarqué que quelques résonances de résidus tout au long de la chaîne présentent des écarts assez importants par rapport aux valeurs attendues. Ainsi, par précaution, nous avons d'abord effectué des calculs ARIA en n'imposant que les cinq liaisons disulfure trouvées par MS : C13–C29, C31–C40, C45–C56, C50–C67 et C69–C7817. Les 20 meilleures structures énergétiques résultantes avaient un écart quadratique moyen (RMSD) de 1,43 +/– 0,39 Å en considérant tous les résidus, et de 1,17 +/– 0,25 Å en considérant uniquement les résidus impliqués dans les voies ordonnées (3–4, 6 , 8–34 36–38, 41–59 et 61–82). Huit violations des contraintes de distance supérieures à 0, 5 Å étaient perceptibles dans l'ensemble structurel final, ainsi qu'un faible chevauchement pour les traics 1–11 et 18–30 (Fig. S2 supplémentaire).

La structure globale de Pvfp-5β est en accord avec ce que l'on attend des critères d'homologie, montrant la présence de deux modules EGF en tandem formés par deux feuilles β antiparallèles exposées au solvant et des régions de bobines aléatoires maintenues ensemble par les ponts disulfure (Fig. S2 supplémentaire ). Le premier module ne contient que deux des trois ponts disulfure attendus pour un domaine de type EGF (C13-C29, C31-C40), tandis que le deuxième module contient trois ponts disulfure comme prévu (C45-C56, C50-C67 et C69- C78). La partie restante de la structure est caractérisée par de longues régions de bobines aléatoires. Ces résultats préliminaires confirment et étendent les prédictions précédentes et prouvent sans aucun doute que la protéine est pliée et structurée.

Pour étudier les propriétés dynamiques de la protéine et concomitamment la présence du sixième pont disulfure, nous avons étudié la relaxation de la protéine à l'échelle de temps ps-ns. Bien que Pvfp-5β ne contienne que peu d'éléments de structure secondaire, les données de relaxation indiquent une protéine relativement rigide, comme le révèlent les valeurs uniformes de 15N-R1, 15N-R2 et hetNOE, à 14, 1 et 18, 8 T (Fig. 1). Des valeurs élevées de 15N-R2 ainsi que de faibles valeurs de R1 et de hetNOE relativement élevées ont été observées pour les résidus C8, N39, Y42, C45, G72, Q77 et Q79, appartenant tous à des régions et/ou boucles non structurées, et pour les résidus T18 et Y27 appartenant à à β1 et β2, respectivement. Cela indique qu'il n'y a pas de mouvements locaux rapides dans l'échelle de temps μs-ms pour ces résidus.

Rapport 15N-R1, 15N-R2, hetNOE et R2/R1 à 298 K mesuré pour tous les résidus Pvfp-5β à 14,1 T (points bleus) et 18,8 T (points rouges). Les brins β sont indiqués par des flèches bleues en haut de la figure, tandis que les courbes jaunes indiquent des liaisons disulfure. Les astérisques noirs indiquent des résidus de proline ou des résidus avec des pics en chevauchement dans les expériences de RMN. Dans les résidus gras montrant des mouvements locaux non rapides dans l'échelle ms-μs.

Pour confirmer que les caractéristiques dynamiques observées sont intrinsèques à la protéine et indépendantes des conditions expérimentales, nous avons répété des expériences de relaxation à différentes températures (288, 293 et ​​303 K) à 18,8 T. Les rapports hetNOE et R2/R1 résultants ont été tracés pour chaque température, et n'a montré aucun changement dans la tendance générale (Fig. S3 supplémentaire). Pour une interprétation plus fiable des données, nous avons également analysé les données en utilisant l'approche de la carte à densité spectrale réduite, qui donne une image qualitative impartiale des mouvements des protéines31 (Fig. S4 supplémentaire). Selon cette analyse, Pvfp-5β présente un schéma typique d'une protéine rigide, avec seulement les résidus 2–4 et 83 identifiables comme flexibles avec peu de restriction des mouvements du vecteur NH du squelette. Les résidus C8 et T18 subissent un échange conformationnel dans l'échelle de temps μs-ms, soutenant la présence du sixième pont disulfure entre C8 et C19. Nous avons donc conclu que nos résultats MS précédents, qui étaient relatifs à la Pvfp-5β étiquetée His, devaient avoir été affectés par la présence de l'étiquette N-terminale, qui aurait pu influencer le potentiel redox de la cystéine C8 N-terminale. Les résidus Y27, N39, G72 et Q77 subissent également un échange conformationnel dans l'échelle de temps μs-ms, tandis que les résidus N6, G23 et G61 sont apparus dans une situation intermédiaire entre flexible et rigide, subissant toujours un mouvement rapide se déplaçant vers une faible valeur de J(0 ).

Un temps de corrélation de 7,8 ns a été obtenu à partir des rapports T1/T2 de 27 résidus avec des valeurs T1 et T2 à moins d'une unité d'écart type de la moyenne. Cette valeur est légèrement plus longue que ce qui est attendu pour une protéine globulaire monomérique de 9,5 KDa, mais cela se justifie par la forme ellipsoïdale allongée de Pvfp-5β, comme le confirme le rapport DII/DI (1,3) du tenseur de diffusion dérivé du dépendance à l'orientation de R2/R1, ce qui indique une anisotropie32.

Ces observations fournissent des informations précieuses sur la dynamique de la protéine et nous amènent à conclure que la Pvfp-5β est une protéine monomérique à pH acide, bien qu'elle ait une forte tendance à s'agréger à pH neutre et basique.

Un deuxième calcul de structure a été effectué imposant le pont disulfure supplémentaire C8-C19 trouvé par nos études dynamiques. Les 20 meilleures structures énergétiques de Pvfp-5β ont un RMSD de 1,42 +/– 0,5 Å pour les atomes du squelette de tous les résidus, et de 1,09 +/– 0,29 Å uniquement sur les atomes du squelette des résidus ordonnés 3–4, 6– 82 (Fig. 2 et Tableau 1). Le nouvel ensemble structurel a entraîné un degré de variabilité plus faible dans la longue extrémité N-terminale en accord avec les données de relaxation, la disparition de certaines violations cohérentes et une définition tout à fait meilleure du faisceau RMN en accord avec le profil de relaxation. La présence de la liaison disulfure supplémentaire C8-C19 au milieu d'une bobine aléatoire N-terminale explique les valeurs plus élevées de 15N-R2 et hetNOE et la présence de la contribution d'échange au résidu C8 ainsi que l'ordre partiel du tract 9- 16. On peut donc considérer ce faisceau comme la structure représentative de Pvfp-5β. Les coordonnées de la structure ont été déposées dans la Protein Data Bank avec le code d'accession 7QAB.

a Superposition des 20 structures de moindre énergie. b Représentation en dessin animé de la structure à la plus basse énergie avec des ponts disulfure en jaune. c Représentation en dessin animé de la structure à la plus basse énergie avec les tyrosines, les lysines et les arginines surlignées en orange, bleu et magenta, respectivement. d Potentiel de surface électrostatique avec résidus acides en rouge et basiques en bleu. e Surface hydrophobe.

Comme dans d'autres protéines de type EGF, Pvfp-5β est presque totalement dépourvu de noyau hydrophobe, comme le confirme également notre analyse des coefficients de température définis comme les rapports dδHN / dT détectés sur la plage de 283 à 303 K (Fig. S5 supplémentaire). Lors de l'affichage de la molécule allongée le long de l'axe longitudinal, l'une des deux surfaces opposées est principalement chargée positivement (Fig. 2d). Des mélanges de tyrosines et de lysines sont répartis le long de la protéine entière (Fig. 2c). Comme prévu, la plupart des résidus situés dans des régions et des boucles non structurées présentaient dδHN/dT < –5 ppb/K, suggérant des liaisons H lâches33. Des valeurs de dδHN/dT < –5 ppb/K ont également été obtenues pour les résidus K21, Y27, C56 et C67 appartenant aux deux feuillets β et indiquant l'exposition de ces résidus au solvant. Les résidus T18, K20, R22, S26, K28, Y30, G57, Y64, Y65, K66 et S68, tous dans des régions de feuillet β, présentaient dδHN/dT > –5 ppb/K confirmant leur implication dans les éléments de structure secondaire et leur stabilité Liaisons H. Des valeurs de dδHN/dT > –5 ont également été observées pour quelques résidus situés dans les virages en U entre les feuillets β, dans les boucles et dans les queues N et C en accord avec une structure globale relativement rigide (Fig. S5 supplémentaire). ).

Comme moyen de validation de la structure, nous avons modélisé Pvfp-5β par intelligence artificielle (IA) à l'aide du logiciel RoseTTAFold dans le serveur Robetta34,35. Nous avons obtenu cinq modèles avec des valeurs de confiance élevées (0,92) et avec les six ponts disulfure. La comparaison de ces modèles avec l'ensemble structurel expérimental final ne montre que des différences mineures intéressant l'interface entre les deux modules de type EGF, qui est légèrement différente en raison d'une différence dans la boucle β3-β4 (Fig. S6 supplémentaire). Cependant, la structure expérimentale RMN est directement soutenue par des NOE sans ambiguïté entre les deux répétitions, et donne un degré de détails que l'on ne peut guère attendre de la nature même des techniques d'apprentissage automatique. Malgré l'énorme capacité de l'intelligence artificielle à prédire la structure, il se peut que certains détails restent au-dessus des prévisions.

Dans une étude précédente, nous avons démontré par diffusion dynamique de la lumière (DLS) que Pvfp-5β a une propension à s'agréger dans des conditions de choc de pH17. Dans le présent travail, nous avons analysé le processus d'auto-assemblage de Pvfp-5β par le colorant fluorescent ThioflavinT (ThT), qui est sensible à la formation de structures β intermoléculaires dans les fibrilles amyloïdes36 et s'accumule dans les coacervats37,38. La fluorescence ThT a été surveillée à la fois par microscopie confocale et par microscopie d'imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM) pour détecter les différentes espèces formées après l'exposition des monomères Pvfp-5β à différents pH.

L'exposition de Pvfp-5β à un environnement alcalin (Tris-HCl 0,1 M pH 8, NaCl 1 M) produit l'apparition progressive de trois espèces protéiques principales. Une apparition soudaine de gouttelettes de coacervation d'un diamètre d'environ 1 μm ou moins est observée peu de temps après l'insulte (Fig. S7a supplémentaire, Film supplémentaire). Le suivi de l'échantillon sur 2 h révèle la formation d'espèces ThT positives de plus en plus grandes avec une apparition finale de structures fibrillaires (Fig. S7b, c supplémentaires). En tant que contrôle, l'incubation de Pvfp-5β à pH 4, 5 n'entraîne aucune espèce ThT-positive (Fig. S7d supplémentaire).

Pour clarifier l'architecture structurelle des assemblages de protéines à l'échelle submicronique et sonder l'évolution des changements structurels microscopiques, FLIM a été utilisé pour analyser la durée de vie de la fluorescence ThT39. Cela a une sensibilité spécifique à la polarité environnementale, à la présence de résidus spécifiques (par exemple, des aromatiques) ou à l'espacement entre les brins β40. Dans un environnement aqueux, le ThT a une durée de vie de l'ordre de la picoseconde, tandis que des durées de vie plus longues sont mesurées dans des milieux à viscosité plus élevée41. Les mesures FLIM ont été analysées à l'aide de l'approche de phaseur, détaillée dans la section Méthodes, qui fournit une vue globale de la désintégration des molécules fluorescentes, n'imposant aucun modèle spécifique comme l'exigent les procédures d'ajustement (Fig. 3)42,43. Les mesures sur le Pvfp-5β coloré au ThT dans un environnement alcalin révèlent trois distributions de durée de vie de fluorescence ThT différentes, identifiées comme des nuages ​​de points distinguables dans le diagramme de phaseur (Fig. 3a), chacune correspondant à l'une des trois principales espèces ThT-positives (gouttelettes de coacervats, assemblages de taille moyenne et espèces fibrillaires). Chaque durée de vie de ThT dans l'échantillon Pvfp-5β est caractérisée par une double décroissance exponentielle, dont les composants principaux ont des durées de vie caractéristiques de τ1 = 0,4 ns et τ2 = 2,4 ns, précédemment trouvées pour les structures amyloïdes colorées au ThT (Fig. 3a)44. La dégradation la plus rapide a été attribuée à des sites de liaison moins spécifiques. Dans ces cas, la fluorescence ThT se produit en raison de la viscosité environnementale accrue. Des désintégrations plus lentes ont été attribuées à une interaction plus spécifique entre ThT et les structures β intermoléculaires qui ajoutent plus de contraintes et moins de flexibilité au site de liaison ThT. Des durées de vie plus courtes ont été mesurées pour les condensats de protéines sphériques à l'échelle du micron facilement formés, révélant leur nature de gouttelettes de coacervation (Fig. 3d). La durée de vie du ThT augmente progressivement pour les espèces plus grandes, ce qui se traduit par une durée de vie plus longue pour les structures à morphologie fibrillaire, indiquant des structures β intermoléculaires denses / denses (Fig. 3e, f). Ces résultats démontrent clairement que la Pvfp-5β non modifiée présente une LLPS dans des conditions semblables à celles de l'eau de mer, contrairement à une étude récente qui montre que seule la Pvfp-5β modifiée par DOPA présentait une LLPS, alors que la version non modifiée ne forme que des agrégats insolubles30.

Analyse de phaseur de mesures FLIM 256 × 256 pixels sur le signal ThT de 1 mg/ml de Pvfp-5β dans Tris-HCl 0,1 M pH 8, NaCl 1 M. a Phaser plot obtenu à partir d'images des différentes espèces présentes dans l'échantillon. Les coordonnées g et s correspondent respectivement aux transformées sinus et 30 cosinus de chaque point du tracé de phaseur. Trois distributions de durée de vie distinctes, mises en évidence par des curseurs circulaires colorés, sont évidentes et reposent sur une ligne droite (en pointillés jaunes) reliant deux phaseurs de décroissance mono-exponentielle avec une durée de vie caractéristique de 2,4 ns et 0,4 ns. b, c, d Images d'intensité de fluorescence, de faible intensité (bleu) à haute intensité (rouge) de gouttelettes de coacervat, d'agrégats de taille moyenne et de fibrilles, respectivement. e, f, g Cartes de durée de vie : chaque pixel est coloré selon le code couleur correspondant du curseur mettant en évidence les distributions de durée de vie dans le diagramme de phase a).

Pour obtenir une impression picturale du processus de coacervation Pvfp-5β se produisant dans l'adhésion des moules, nous avons utilisé la structure expérimentale de Pvfp-5β pour effectuer l'amarrage moléculaire du dimère Pvfp-5β / Pvfp-5β afin de prédire quelle surface pourrait initier l'auto-assemblage . L'amarrage du dimère par HADDOCK a abouti à trois clusters, parmi lesquels le premier est le plus peuplé (177 structures) avec le meilleur HADDOCK et Z-score avec un RMSD total de 0,6 ± 0,3 Å de la structure globale à plus faible énergie (Supplémentaire Tableau 2). Les dimères résultants sont placés tête-bêche avec un axe de symétrie D2 avec un noyau hydrophobe bien structuré impliquant Y27, Y62 et Y65 des deux monomères (Fig. 4). Le complexe est stabilisé par un certain nombre d'interactions π-π et cation-π et par un réseau étendu de liaisons hydrogène à l'interface entre les deux monomères (tableau supplémentaire 3). Un amarrage supplémentaire entre les dimères suggère qu'ils pourraient interagir les uns avec les autres par le biais de tyrosines exposées supplémentaires sur la surface externe du dimère. Ceci impliquerait une orientation de la structure monomère allongée perpendiculaire à l'axe de la fibre.

Structure d'énergie la plus basse du dimère Pvfp-5β / Pvfp-5β telle que calculée par HADDOCK. une représentation de dessin animé avec des résidus des deux composants impliqués dans l'interaction montrés dans des bâtons. b, c potentiel de surface électrostatique pour un monomère et représentation de bande dessinée pour l'autre.

Dans ce travail, nous rapportons la structure expérimentale en solution de Pvfp-5β, l'une des protéines de moule impliquée dans l'adhésion de surface par la formation de la plaque de byssus. La séquence protéique contient deux modules EGF en tandem reliés par un lieur. Les modules de type EGF sont des motifs évolutifs conservés caractérisés par trois ponts disulfure conservés, qui maintiennent ensemble une structure autrement trop petite pour contenir un noyau hydrophobe approprié. En raison de la présence des disulfures, ils sont généralement repliés de manière stable et se trouvent dans les domaines extracellulaires des protéines liées à la membrane et dans les protéines connues pour être sécrétées. Il est donc raisonnable de supposer qu'ils conduiront également à une protéine structurée dans Pvfp-5β.

En conséquence, notre travail confirme ces attentes et fournit plus d'informations. Tout d'abord, il convient de préciser qu'il existe une certaine confusion dans la littérature où Pvfp-5β est déclarée comme une protéine de bobine aléatoire alors qu'en même temps, il est reconnu qu'elle contient des motifs de type EGF17,18,30. Il est vrai que Pvfp-5β a de longues boucles non structurées, mais, en même temps, il est tout à fait incorrect de considérer l'EGF comme une protéine intrinsèquement non structurée : comme tous les petits modules (moins d'environ 50 acides aminés), il a besoin de ponts disulfures. être maintenu en place, comme on le voit dans plusieurs neurotoxines et dans le BPTI45. En conséquence, les caractéristiques du spectre CD ne sont pas celles d'une bobine aléatoire puisque le minimum unique est décalé à 205 nm (à comparer à 200 nm dans les protéines de bobine aléatoire) et ressemble fortement à celui d'un autre module protéique petit mais bien structuré, le domaine WW46, qui partage également avec Pvfp-5β une bande positive autour de 230 nm qui est probablement causée par l'empilement de chaînes latérales aromatiques17. En accord avec ce point de vue, nous avons observé tout un réseau de NOE intramoléculaires, ce qui nous a rassurés sur le fait que la protéine est repliée et a une structure robuste même en l'absence d'un noyau hydrophobe approprié. Nous avons également des preuves directes concluantes que, dans des conditions acides, Pvfp-5β est monomérique.

Nos résultats sont donc en forte contradiction avec un article récent dans lequel les spectres RMN sont rapportés à la fois pour le Pvfp-5β30 tyrosiné et DOPAminé. Dans cet article, les auteurs ont montré des spectres unidimensionnels et bidimensionnels, qui présentent toutes les caractéristiques d'une protéine agrégée entièrement non structurée. Les mêmes auteurs n'ont pas été en mesure d'observer les NOE, que nous observons plutôt de manière intensive, comme on s'y attend pour une protéine monomère de type EGF. L'écart est bien sûr possible étant donné que la Pvfp-5β est une protéine difficile à produire, notamment chez les bactéries, où elle forme des corps d'inclusion qui nécessitent d'être solubilisés par un protocole de repliement robuste et fiable.

Il a été suggéré indépendamment que la rigidité du pli Pvfp-5β est nécessaire pour favoriser l'adhésion et la formation de byssus. En effet, nos paramètres de relaxation RMN, tels que les hetNOEs, nous permettent clairement d'affirmer que le squelette est relativement rigide avec une flexibilité accrue dans l'échelle de temps ps-ns observée uniquement aux extrémités et dans la boucle β1/β2. Une analyse plus approfondie de la carte de densité spectrale nous a permis d'identifier les résidus qui semblaient affectés par le mouvement de l'échelle de temps μs-ms, parmi lesquels N39, dans la longue boucle désordonnée entre β2 et β3, est le plus affecté. Il est donc raisonnable de considérer que N39 agit comme une charnière entre les deux modules EGF. Les résidus de lysine et de tyrosine apparaissent exposés au solvant et peuvent ainsi agir en synergie pour interagir avec les surfaces également en l'absence de modifications DOPA. La rigidité globale, favorisée par la présence de ponts disulfure, pourrait donc être une caractéristique structurelle principale pour remplir la fonction en favorisant l'exposition persistante des résidus de tyrosine et de lysine au solvant, en maximisant l'interaction avec les surfaces et/ou d'autres protéines, tout en minimisant la pénalité d'entropie.

La distribution des plis et des résidus explique également pourquoi Pvfp-5β est la protéine de première ligne dans le processus d'adhésion chez Perna viridis. Sa forme allongée et l'exposition de tant de points chauds d'interaction sont idéales pour l'adhésion aux substrats marins. Sur la base de la structure, il est donc facile de prédire que, dans la plaque de byssus, les différents monomères vont s'empiler en interagissant de manière perpendiculaire à l'axe principal des fibres, comme dans le cross-β d'une fibre amyloïde (Fig. 5). Lors de l'examen des autres composants de la plaque de byssus, nous pourrions raisonnablement supposer que le complexe exposera une partie de la fente formée par le lieur non structuré entre les deux modules EGF. Cette fente pourrait accueillir d'autres protéines du pied qui pourraient contribuer à la formation de fibres.

La forme allongée du Pvfp-5β et l'exposition de nombreux points chauds d'interaction sont idéales pour la formation de fibres. Différentes unités peuvent s'empiler en interagissant de manière perpendiculaire à l'axe principal des fibres, comme dans la croix-β d'une fibre amyloïde.

Enfin, nous avons démontré que la DOPA n'est pas nécessaire également pour la LLPS car nous observons la coacervation simplement en modifiant le pH et la concentration en sel de la solution. Le comportement différent observé dans une étude précédente30 pourrait encore s'expliquer par la nature différente des échantillons. Ceci est en plein accord avec nos résultats et les résultats d'autres montrant que le DOPA n'est pas essentiel pour l'adhérence17,22.

En conclusion, notre travail constitue une tentative structurelle directe pour comprendre la reconnaissance moléculaire des protéines de moules au niveau moléculaire et fournit un modèle pour la formation de plaques de byssus de moules. Nos résultats peuvent expliquer pourquoi la DOPA peut être importante pour la coacervation de Pvfp-5β mais ne contribue pas aux propriétés d'adhésion de cette protéine en accord avec les preuves expérimentales17,22. La DOPA peut facilement favoriser le compactage et une réticulation plus efficace des monomères dans le coacervat et contribuer à sa stabilité. Plusieurs questions restent ouvertes sur le processus de coacervation dans l'adhésion des moules : on ne connaît pas, par exemple, la stoechiométrie complexe ou la contribution relative des différents composants, ni la cinétique précise des événements qui peuvent avoir lieu. Nous ne savons pas non plus précisément comment la présence de DOPA pourrait influencer le mode de liaison. Des travaux supplémentaires seront donc nécessaires pour répondre à ces importantes questions ouvertes.

Le clonage, l'expression bactérienne dans E. coli et la purification ont été réalisés comme précédemment publié avec des ajustements mineurs17. En bref, la Pvfp-5β recombinante a été exprimée dans des cellules E. coli BL21 (DE3) pLysS sous la forme d'une protéine à étiquette His N-terminale clivable par la protéase TEV. L'expression a été induite par 1 mM d'isopropil-β-d-1-tiogalattopiranoside pendant 3 h à 37 ° C. Le marquage a été réalisé en cultivant les cellules dans un milieu minimal en utilisant du sulfate d'ammonium 15N et du glucose 13C comme seules sources d'azote et de carbone. Les cellules ont été désintégrées par des homogénéisateurs à ultrasons. Les corps d'inclusion ont été resolubilisés dans de l'urée 8 M, NaCl 1 M, DTT 2 mM, tampon phosphate de sodium 20 mM à pH 7,4. Le surnageant a été passé dans une colonne brute HisTrap FF de 5 ml pré-remplie de Ni-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences). La protéine a été éluée dans des conditions dénaturantes et réductrices avec un gradient linéaire d'imidazole. Le repliement a ensuite été effectué par dialyse extensive à 4 ° C, d'abord dans du phosphate de sodium 20 mM (pH 7,4), de l'urée 2 M, du NaCl 250 mM, du glutathion réduit 2 mM (GSH) et du glutathion oxydé 0,5 mM (GSSG), puis dans le même tampon sans urée, et enfin dans 20 mM de phosphate de sodium à pH 7,4 et 250 mM de NaCl. L'élimination de l'étiquette His a été effectuée en ajoutant de la protéase TEV à un rapport molaire de 1:50 à la solution de protéines et en incubant à température ambiante pendant 2 h. La Pvfp-5β clivée a été récupérée par chromatographie IMAC inverse. En raison de ses fortes caractéristiques adhésives, le Pvfp-5β clivé n'a pas été collecté dans le flux de la colonne comme prévu, mais il a été élué avec un gradient d'imidazole, ce qui a permis sa séparation de l'étiquette. Une dialyse extensive a ensuite été effectuée à 4 ° C dans du phosphate de sodium 20 mM à pH 7, 4 et du NaCl 250 mM pour éliminer l'imidazole, puis dans de l'acide acétique à 5%, ce qui a permis une lyophilisation facile de l'échantillon de protéine. La pureté des protéines a été vérifiée par analyse SDS-PAGE. La concentration en protéines a été évaluée par détermination spectrophotométrique UV à 280 nm (coefficient d'extinction [ε] = 26080 M-1 cm-1).

Les mesures RMN tridimensionnelles pour l'attribution des résonances ont été effectuées à 800 MHz sur des spectromètres Bruker et 298 K. T1, T2 et les NOE hétéronucléaires ont été mesurés à 600 et 800 MHz sur des spectromètres Bruker et 298 K en utilisant des séquences d'impulsions standard. Deux échantillons différents ont été préparés dans du tampon acétate 20 mM pH 4,5, l'un à une concentration de ~ 350 μM, le second à ~ 900 μM. Tous les spectres RMN ont été traités à l'aide de nmrPipe47 et analysés par le logiciel CCpnmr48.

Les pics 15N,1H HSQC49 ont permis d'identifier les résonances des groupes amides du squelette qui ont ensuite été attribués aux acides aminés correspondants par analyse des expériences HN(CO)CACB50, HN(CO)CA51 et HNCA52, HNCACB53, qui ont également fourni des valeurs de déplacement chimique d'atomes Cα et Cβ conduisant à une affectation spécifique à la séquence. Le spectre HNCO54 a été utilisé pour attribuer les déplacements chimiques du carbone carbonyle, tandis que les valeurs de déplacement chimique de Hα et Hβ ont été attribuées par les expériences HBHA(CO)NH55 et HBHANH56. Les résonances HN et N de 73 des 75 résidus non proline ont été attribuées et utilisées dans le logiciel TALOS +57, ainsi que les résonances attribuées de HA, CA, CB et CO, pour la prédiction empirique des angles dièdres ψ et ϕ, et structure secondaire.

L'affectation des chaînes latérales a été réalisée par des expériences 3D HCCH-TOCSY58, enregistrées individuellement pour les chaînes aliphatiques et aromatiques. Les spectres 2D (HB)CB(CGCD)HD59 et (HB)CB(CGCD)CEHE60 ont été utilisés pour attribuer les protons Hδ et Hε des résidus aromatiques. Les résonances manquantes ont été attribuées par 13C NOESY-HSQC61.

La structure de Pvfp-5β a été calculée avec ARIA2.362. Les données d'entrée étaient la séquence d'acides aminés Pvfp-5β, la liste d'attribution des déplacements chimiques, les listes de contraintes NOE, les angles dièdres obtenus par TALOS + et les liaisons hydrogène obtenues par la suite de modélisation des protéines Rosetta63. Des contraintes de pont disulfure ont également été imposées sur les paires C13-C29, C31-C40, C45-C56, C50-C67 et C69-C78 selon une analyse par spectrométrie de masse précédente17. Un calcul de structure supplémentaire a été effectué, imposant une liaison disulfure supplémentaire impliquant C8 et C19, comme suggéré par les mesures de relaxation. Les contraintes NOE ont été attribuées manuellement par analyse de 3D 15N NOESY-HSQC64, 3D 13C NOESY-HSQC61 centré sur la région aliphatique (0–6 ppm) et 3D 13C NOESY-HSQC centré sur la région aromatique (6–8 ppm). Les affectations NOE ambiguës ont été triées automatiquement par ARIA au cours de huit itérations, en sélectionnant les 100 meilleurs conformateurs à chaque itération. Un seuil de violation différent a été défini pour chaque itération : 200,0 pour it0, 6,0 pour it1, 3,0 pour it2, 2,0 pour it3, 1,0 pour it4 et it5, 0,5 de it6 à it8. Les conformères avec les valeurs d'énergie les plus basses ont été utilisées pour filtrer les contraintes de distance des faux positifs et attribuer des ambiguïtés. Les calculs ARIA ont été effectués avec le choix adaptatif de la tolérance de violation. La tolérance d'attribution sur les fréquences des listes de pics NOESY était de 0,02 ppm pour 1H et de 0,4 ppm pour les noyaux 15N et 13C. Des contraintes de liaison hydrogène ont été imposées pour les paires T18-Y30, K20-K28, T55-S68 et G57-Y66. Un potentiel de retenue de distance log-harmonique a été supposé. Ce potentiel découle d'une analyse bayésienne montrant que les NOE et les distances dérivées suivent idéalement la distribution log-normale65,66. Un potentiel log-harmonique a été appliqué pendant la deuxième étape de refroidissement du recuit simulé et pendant le raffinement de l'eau. L'ensemble structurel a été visualisé et analysé à l'aide de Chimera et de Pymol67,68. La validation de la qualité a été effectuée à l'aide de PROCHECK69 et de la suite logicielle de validation de la structure des protéines (PSVS, https://www.bio.tools/psvs#!).

Les coefficients de température de déplacement chimique de l'amide 1HN de Pvfp-5β ont été déterminés en enregistrant une série de spectres bidimensionnels 15N, 1H HSQC à 283, 288, 293, 298 et 303 K, à l'aide d'un spectromètre Bruker fonctionnant à une fréquence de protons de 800, 03 MHz. Tous les spectres ont été référencés au signal de l'eau pour chaque température, traités à l'aide de nmrPipe47 et analysés par le logiciel CCpnmr48. Le déplacement chimique de l'eau a été référencé à l'acide 3-(triméthylsilyl)propane-1-sulfonique (DSS), qui a une dépendance à la température négligeable et permet une analyse non biaisée par l'artefact de verrouillage du deutérium. Les valeurs de déplacement chimique δHN de tous les résidus ont été tracées en fonction de la température. Les données ont été analysées en supposant que les résidus avec dδHN/dT < –5 ppb/K forment des liaisons H plus faibles et doivent être considérés comme des points de rupture de structure secondaire ou, s'ils se trouvent dans une région non structurée, comme des promoteurs de liaisons H avec l'eau. Les valeurs de dδHN/dT > –5 ppb/K correspondent à la formation de liens plus serrés probablement impliqués dans les éléments de structure secondaire70.

La dynamique du squelette de Pvfp-5β a été sondée à 298 K avec la relaxation 15N-R1, 15N-R2 et l'effet Overhauser nucléaire hétéronucléaire {1H}–15N (hetNOE)71,72,73,74 sous deux champs magnétiques différents (14,1 et 18,8 T). 15N-R1, 15N-R2 et {1H}–15N NOE ont également été mesurés à trois autres températures (288, 293 et ​​303 K) sous le seul champ magnétique de 18,8 T. Dans tous les cas, R1 et R2 ont été mesurés avec des retards variant de 0,01 à 2 s, et entre 0,017 et 2,7 s, respectivement. Les données NOE à l'état stable {1H}-15N ont été obtenues en mesurant deux spectres : un spectre initial enregistré sans la saturation initiale des protons et un second spectre enregistré avec une saturation initiale des protons de 8 s. Les valeurs de NOE ont ensuite été déterminées à partir des rapports des intensités moyennes des pics avec et sans saturation en protons.

Les données de relaxation acquises à 298 K, obtenues à des champs magnétiques de 18,8 T et 14,1 T, ont été analysées par le formalisme mathématique standard sans modèle75 disponible dans l'outil Dynamic Center fourni par la plate-forme Bruker topspin. Les données expérimentales ont été traitées et ajustées en utilisant deux structures différentes avec 5 et 6 ponts disulfure. Une analyse plus approfondie des données de relaxation acquises à différentes températures a été réalisée en utilisant l'approche de la fonction de densité spectrale31,32. La température a été vérifiée en surveillant les changements de déplacement chimique des pics sélectionnés. Aucune surchauffe de l'échantillon n'a été observée à la suite de l'application d'impulsions de radiofréquence. Sur les 83 acides aminés présents, quinze résidus ont été exclus de l'analyse soit parce qu'ils sont des prolines, soit parce qu'ils se chevauchent dans le HSQC 15N (P5, P7, P10, Y11, P12, C13, G37, A44, P47, P49, Y58 , Y60, P63, P70, G75).

Des modèles structuraux de Pvfp-5β ont été obtenus à l'aide de la suite RoseTTafold76. C'est l'un des outils informatiques basés sur un réseau d'apprentissage en profondeur capable de prédire la structure d'une protéine à partir de sa séquence d'acides aminés. Le réseau d'apprentissage en profondeur est capable d'effectuer une série d'opérations de convolution 1D, 2D et 3D pour augmenter la précision du modèle structurel protéique résultant. Les combinaisons d'alignements de séquences multiples, de cartes de distance et de représentations de coordonnées tridimensionnelles donnent lieu à un meilleur modèle structurel par rapport aux méthodes de prédiction plus traditionnelles basées sur des alignements de séquences multiples et des cartes de contact. Le logiciel a généré cinq modèles, dont les différences sont mises en évidence sous forme d'estimations d'erreur d'angström par rapport à la position de chaque résidu dans la séquence. La qualité de la prédiction est définie par un niveau de confiance, qui est lié à l'IDDT prédit (test de différence de distance locale) utilisé dans DeepAccNet77. Nous avons obtenu un niveau de confiance de 0,92 pour Pvfp-5β.

La Pvfp-5β lyophilisée a été dissoute dans de l'acide acétique 10 mM jusqu'à la concentration finale de 10 mg/ml. La solution a ensuite été diluée à 1 mg/ml dans de l'acétate de sodium 20 mM à pH 4,5 ou Tris-HCl 0,1 M à pH 8 et NaCl 1 M, et colorée avec 40 uM d'une solution aqueuse de ThT. 250 microlitres d'échantillons colorés ont été placés sur des lames à chambre de microscope et imagés à une résolution de 1024 × 1024 pixels à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP5, en utilisant un objectif à huile 63x (Leica Microsystems, Allemagne). Le laser à lumière blanche Leica a été réglé à une excitation de 470 nm et l'émission de ThT a été détectée dans la plage de 485 à 585 nm.

Les données FLIM ont été acquises dans le domaine temporel au moyen d'un module TCSPC autonome picoHarp 300 (Picoquant), en utilisant un objectif à huile 63 × (Leica Microsystems). Des images de 256 × 256 pixels ont été acquises à une fréquence de balayage de 200 Hz, avec un laser à lumière blanche Leica réglé pour exciter ThT (λex : 470 nm, λem : 485–585 nm). L'étalonnage FLIM du système a été effectué en mesurant la durée de vie connue de la fluorescéine qui est une durée de vie unique de 4,0 ns. Les données FLIM ont été analysées par l'approche phaseur42,43 par le logiciel SimFCS développé au Laboratory of Fluorescence Dynamics, University of California at Irvine (www.lfd.uci.edu). L'approche phaseur est une technique du domaine de Fourier qui permet l'analyse graphique des mesures FLIM. Il transforme la décroissance de la fluorescence mesurée dans chaque pixel de l'image en un seul point appelé "phaseur" dans une représentation polaire. Toutes les décroissances à exponentielle unique possibles reposent sur un demi-cercle (défini comme cercle universel), de rayon 1/2, allant du point (0, 0), correspondant à τ = ∞, au point (1, 0), correspondant à τ = 0. Les désintégrations complexes sont une combinaison linéaire d'exponentielles simples et sont représentées dans le demi-cercle. Etant donné que les phaseurs suivent l'algèbre vectorielle, il est possible de résoudre géométriquement les fractions de deux espèces fluorescentes (dans le cas le plus simple) par la règle du levier des additions vectorielles. La combinaison linéaire de deux composants de décroissance exponentielle unique génère des phaseurs à l'intérieur du cercle universel, qui reposent sur une ligne droite joignant les phaseurs des deux composants uniques. La contribution/fraction d'un seul composant à la durée de vie est proportionnelle à la distance du phaseur par rapport à celui-ci.

Pour les mesures Pvfp-5β, les distributions de durée de vie ont été sélectionnées avec un curseur vert, cyan et rouge et les pixels correspondants ont été localisés avec le même code couleur dans les images. Les pixels verts sont liés à des durées de vie plus courtes. Les durées de vie progressivement croissantes sont cartographiées en utilisant la couleur cyan et rouge.

Les calculs d'amarrage des interactions protéine-protéine pour le complexe Pvfp-5β/Pvfp-5β ont été effectués ab-initio à l'aide de la plateforme de modélisation intégrative HADDOCK2.478,79. Au cours du protocole d'amarrage HADDOCK, les partenaires en interaction sont traités comme des corps rigides dans la phase initiale, tandis que la deuxième étape introduit de la flexibilité aux partenaires en interaction grâce à un raffinement basé sur la dynamique moléculaire en trois étapes afin d'optimiser l'emballage de l'interface. Les résidus appartenant à la région d'interface sont ensuite autorisés à déplacer leurs chaînes latérales dans une deuxième étape de raffinement. Un raffinement final dans une coquille de solvant est ensuite effectué pour améliorer l'énergétique de l'interaction. Les complexes protéine-protéine résultants sont classés en fonction du score HADDOCK, qui est une somme pondérée de plusieurs termes tels que les énergies électrostatiques, de van der Waals et de contraintes de distance, et la surface enterrée.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

L'attribution RMN a été soumise à la BioMagResBank (BMRB : www.bmrb.wisc.edu, https://doi.org/10.1093/nar/gkm957) sous le numéro d'accession 51091. Les coordonnées de la structure RMN ont été déposées dans le Protein Data Bank (PDB : www.rcsb.org, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7000-1_26) sous le code d'accession 7QAB. Toutes les autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Le travail à la Fondazione Ri.MED a été soutenu par Patto per il Sud Regione Siciliana—Grant "CheMISt" (CUP G77B17000110001), et PO FESR Sicilia 2014/2020 Azione 1.5.1.—Grant "Potenziamento Infrastruttura di Ricerca "GMP Facility, Laboratori di Ricerca e Servizi Diagnostici e Terapeutici IRCCS-ISMETT" (CUP G76G17000130007), Partenariat IRCCS-ISMETT/Fondazione Ri.MED. AP a été soutenu par l'Institut Francis Crick par la fourniture d'un accès au Centre de RMN biomédicale du MRC. L'Institut Francis Crick reçoit son financement de base de Cancer Research UK (FC001029), du UK Medical Research Council (FC001029) et du Wellcome Trust (FC001029). Nous tenons à remercier le Centre ATeN de l'Université de Palerme pour son soutien aux infrastructures. Nous remercions également Nadia Consiglio pour son aimable aide dans la réalisation de la Fig. 5.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Maria Agnese Morando, Francesca Venturella.

Unité de biologie structurale et biophysique, Fondazione Ri.MED, 90133, Palerme, Italie

Maria Agnese Morando, Francesca Venturella, Martina Sollazzo, Elisa Monaca, Raffaele Sabbatella & Caterina Alfano

Département des sciences et technologies biologiques, chimiques et pharmaceutiques (STEBICEF), Université de Palerme, 90128, Palerme, Italie

Martina Sollazzo

Département de physique et chimie—Emilio Segrè (DiFC), Université de Palerme, 90128, Palerme, Italie

Valéria Vetri

Institut de biophysique, Conseil national de la recherche, 90143, Palerme, Italie

Rosa Passantino

Installation Européenne de Rayonnement Synchrotron, Ave des Martyrs, 38000, Grenoble, France

Annalisa Berger

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Conceptualisation CA et AP ; Préparations d'échantillons FV, ​​EM, RS et RP ; Acquisition de données CA, MAM et MS ; Analyse des données MAM, FV, MS, VVAP et CA ; Conservation des données AP et CA ; AP et CA ont rédigé le manuscrit ; CA supervision, ressources et acquisition de financement.

Correspondance à Caterina Alfano.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce manuscrit a déjà été évalué dans une autre revue Nature Portfolio. Le manuscrit a été jugé apte à être publié sans autre examen par Communications Biology. Rédacteur en chef principal : Gene Chong.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Morando, MA, Venturella, F., Sollazzo, M. et al. La structure de la solution de Pvfp-5β recombinante révèle des informations sur l'adhésion des moules. Commun Biol 5, 739 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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Reçu : 02 février 2022

Accepté : 11 juillet 2022

Publié: 25 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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